Ki 67 рак поджелудочной железы

Введение. Рак мочевого пузыря (РМП) является самым частым онкологическим заболеванием мочевыделительной системы. В 2011 году в Российской Федерации диагностировано 13784 случая РМП, при этом прирост этого заболевания за последние 10 лет составил 15,26%. Летальность от РМП на первом году с момента установления диагноза составляет 19,5%.  [1,2], поэтому диагностика и лечение больных раком мочевого пузыря (РМП) является одной из актуальных проблем  урологии.

По клиническому течению выделяют мышечнонеинвазивный (Tis, Ta, T1), мышечноинвазивный (T2-T4) и метастатический РМП. Поверхностные и мышечноинвазивные опухоли мочевого пузыря в 90-95% представлены уротелиальной карциномой, но отличаются по целому ряду молекулярно-генетических, морфологических и иммуно-гистохимических признаков.

Мышечноинвазивный рак мочевого пузыря (МИРМП) — потенциально смертельное заболевание, так как без лечения больные погибают в течение 24 месяцев. У 50% больных МИРМП, оперированных радикально, развивается рецидив, что связано с морфологической стадией  развития первичной опухоли и состоянием регионарных лимфатических узлов. Наиболее распространенная локализация метастазов уротелиального рака —  регионарные лимфатические узлы (78%), печень (38%), легкие(36%), кости (27%), надпочечники (21%) и кишечник (13%), реже (1%- 8%) развиваются метастазы  в сердце, головном мозге, почках, селезенке, поджелудочной железе, мозговых оболочках, матке, яичниках, простате и яичках[3,4,5]. Следует отметить, что в течение первого года  развития заболевания группу  МИРМП пополнят еще  15-30% больных с поверхностным РМП, у которых возникает рецидив опухоли с мышечной инвазией  [6].

 В России в 2011 году среди зарегистрированных впервые выявленных больных в 45,8% случаев диагностируются I — II, в 37,6% –III и в 16,6% –IV стадии РМП. В большинстве случаев органосохраняющее лечение удается провести только в Т1-Т2 стадиях заболевания. В Т3-Т4 стадиях выполняется цистэктомия или паллиативное лечение. Правильно выбранная тактика лечения является принципиальным моментом для  дальнейшей жизни больного. Так, после удаления мочевого пузыря качество жизни больных  значительно снижается,  и им устанавливается 1 — 2 группы инвалидности. В то же время неоправданно длительное консервативное лечение может привести к гибели больных [7].

Сегодня изучено влияние на течение РМП более 30 прогностических факторов и  установлено, что независимыми факторами, влияющими на общую выживаемость, являются только стадия опухоли и поражение метастазами регионарных лимфатических узлов (EAU-2009).

Результаты лечения РМП непосредственно связаны со стадией заболевания. Так, пятилетняя выживаемость в Т1 стадии составляет 90-80%, в Т2 – 70-63%, в Т3 – 53-32% и в Т4 – 28-5%  [8]. Вместе с тем частота ошибок в предоперационном периоде при определении стадии рака мочевого пузыря   достигает 73% [9].   Даже  морфологическое  исследование может давать  ошибку в определении  глубины инвазии опухоли в  20-50%  [10].  

Дооперационная диагностика метастазов в регионарных лимфатических узлах является неудовлетворительной. Компьютерная томография позволяет выявить только 35-40% метастатически пораженных лимфатических узлов, а тонкоигольная аспирационная биопсия лишь незначительно улучшает диагностику, так как ее чувствительность не превышает 60%, а выполняется эта процедура лишь при увеличенных лимфоузлах [11].   

Поражение регионарных лимфатических узлов при инвазивном раке мочевого пузыря является крайне неблагоприятным прогностическим фактором. Показано, что после цистэктомии 50% больных умирают в течение 12 месяцев с регионарными метастазами в лимфатические узлы и 87% в течение 24 месяцев; пятилетняя выживаемость составляет менее 7%. Расширенная лимфодиссекция и системная химиотерапия достоверно улучшает выживаемость этих больных, поэтому дооперационная диагностика метастазирования в лимфоузлы может существенно повлиять  на выбор тактики лечения в этой группе больных [12].  

Кроме глубины инвазии опухоли и метастатического поражения лимфатических узлов, на прогноз МИРМП влияет степень злокачественности переходно-клеточной карциномы. Однако при мышечно-инвазивном РМП, как правило,  не встречаются  уротелиальные опухоли с низким злокачественным потенциалом или высокодифференцированные (G1) карциномы. Во всех случаях определяется уретериальный  рак высокой степени злокачественности (G2 или G3 по классификации ВОЗ, 1973). В связи с этим дальнейшая дифференциация МИРМП не несет никакой прогностической информации [13].

Ошибки в стадировании заболевания на основании клинических и рутинных гистологических исследований стимулировали интерес к иммуногистохимии, позволяющей прогнозировать характер течения болезни у каждого конкретного больного на основании изучения молекулярных маркеров. Наиболее изученными генами, вовлеченными в регуляцию клеточного цикла, являются гены-супрессоры опухоли p53 и p21. Ген р53 регулирует клеточный цикл и апоптоз, контролирует целостность генома. Активируясь в ответ на самые разные неблагоприятные воздействия, p53 осуществляет на транскрипционном уровне одновременно и активацию гена bax, и супрессию гена bcl-2, отвечающих за апоптоз. При развитии неоплазий, в том числе и переходно-клеточных карцином, часто отмечаются соматические мутации гена р53. Мутации Р53 при карциномах уротелия выявляют в  29-53%  случаях, однако мнения авторов о прогностической ценности этого показателя противоречивы [14].

Пролиферативная активность клетки может быть оценена при помощи различных методик. К ним относятся подсчет количества митозов Ki-67-позитивных клеток, выявление антигена ядра пролиферирующей клетки (PCNA), Р63. Антитела к Ki-67 применяют для оценки пролиферативной активности многих новообразований.  Его прогностическая ценность  доказана при поверхностном раке мочевого пузыря[15]. Исследование Ki-67 позволяет прогнозировать темп роста опухоли и реакцию опухоли на проводимую химиотерапию. Ki-67 так же является независимым прогностическим фактором в отношении рецидивирования у больных с поверхностными формами РМП, имеющих высокий риск  [6]. Сведения о влиянии Ki-67 на прогноз у больных с МИРМП противоречивые и изучены недостаточно.

Цель  исследования: провести сравнительную оценку эффективности различных иммуногистохимических маркеров в определении стадии и прогнозе мышечно-инвазивного РМП.

Материалом для исследования послужил операционный материал  80 пациентов с новообразованиями мочевого пузыря, проходивших лечение в НИИ клинической и фундаментальной уронефрологии СГМУ и группе контроля (таб.1).

Операционный и биопсийный материалы были фиксированы в 10% –ном растворе нейтрального формалина и залиты в парафин. Срезы толщиной 5-7 мкм, окрашенные гематоксилином и эозином, были подвергнуты обзорному морфологическому анализу, при котором стадию рака определяли в соответствии с классификацией TNM,  а степень дифференцировки опухолевых клеток оценивали в соответствии с рекомендациями ВОЗ, 2004. Изучение препаратов было проведено с применением бинокулярного микроскопа «Micros MC100» при 600-кратном увеличении (объектив — 40х, бинокулярная насадка — 1,5х, окуляры — 10х). Материал был разделен по группам с учетом клинической стадии рака. Всего было исследовано 94 образца.

Исследовано 3120 срезов, окрашенных гематоксилином и эозином, и на 12 различных маркеров. 

Для иммуногистохимического исследования были использованы 12 коммерческих моноклональных антител, разделенных на группы по функциональной значимости:

• маркеры пролиферативной активности –Ki67, PCNA, p63,
• супрессор опухолевого роста – р53,
• маркер апоптоза Bcl2,
• рецептор эпидермального фактора роста — EGFR,
• цитокератиновый профиль – ЦК7, ЦК8, ЦК10/13, ЦК17, ЦК18, ЦК19.

Методика иммуногистохимического окрашивания

Иммуногистохимические реакции ставили на серийных парафиновых срезах (5мкм), используя  стрептавидин-биотиновый метод. В качестве детекционной системы применяли систему LSAB2 System, HRP (K0675), Dako, в качестве хромогена – диаминобензидин (Dako).

Интенсивность реакций, локализованных в цитоплазме (цитокератины 7,8,13, 17,18,19) и на мембранах клеток (EGFR) оценивали полуколичественным способом по балльной шкале от 0 до 3 с помощью светового бинокулярного микроскопа «MicrosMC100»,  учитывая выраженность реакции и ее локализацию: 0 – отсутствие реакции, 1 – слабая реакция, 2 – умеренная реакция, 3 – сильная реакция.

Результаты реакций с антигенами, имеющими ядерную локализацию (PCNA, Ki67, p53, p63, bcl2), оценивали, подсчитывая количество окрашенных ядер на 100 ядер в 3 полях зрения, выражая полученные результаты в процентах.

Результаты реакций с антигенами, имеющими ядерную локализацию (PCNA, Ki67, p53, p63, bcl2) оценивали по системе подсчета histochemicalscore .  Система подсчета включает в себя интенсивность иммуногистохимической окраски по 3-х бальной шкале и долю (%) окрашенных клеток и представляет собой сумму произведений процентов, отражающих долю клеток с различной интенсивностью окраски на балл, соответствующий интенсивности реакции.    Интенсивность окраски 0 – нет окрашивания, 1 – слабое окрашивание, 2- умеренное окрашивание, 3 – сильное окрашивание. 

Формула подсчета следующая:  histochemicalscore = ∑ P (i) х i,

где  i  — интенсивнось окрашивания, выраженная в баллах от 0 до 3. P (i) – процент клеток, окрашенных с разной интенсивностью. Максимальное значение гистосчета должно соответствовать 300. 

Статистический анализ проводили с использованием пакета программ статистической обработки результатов SSPS 13.0 forWindows.

Результаты.  При иммуногистохимическом исследовании  12 онкомаркеров было установлено, что для установления стадии  рака мочевого пузыря и прогноза заболевания рационально использовать только 4: маркеры пролиферативной активности Ki67,  p63, супрессор опухолевого роста – р53 и рецептор эпидермального фактора роста — EGFR. В таблице 2 дана    сравнительная оценка эффективности иммуногистохимических маркеров для определения стадии РМП.

Из таблицы 2  видно, что все эти маркеры не дают положительной экспрессии в  группе сравнения, что может использоваться при дифференциальной диагностике

РМП и других неоплазий. Кроме этого,  процент экспрессирующих клеток указанных маркеров позволяет судить о степени инвазии  РМП, что является важным  моментов для определения стадии заболевания, следовательно, и прогноза. Именно поэтому Ki 67 весьма перспективно можно использовать для дифференциальной диагностики  между Т2 и Т3-Т4, что является весьма важным, так как выход опухоли за пределы органа свидетельствует о неблагоприятном прогнозе. Он  может быть использован, как прогностический, способный повлиять на выбор тактики лечения у больных МИРМП.

При  анализе показателей экспрессии маркеров в каждой из стадий РМП, представленной в таблице 3, установлено, что маркер Ki 67 показал 100% -ную экспрессию у пациентов со стадией РМП Т3 и  Т4, в то время как в стадии Т2 его экспрессия составила только 56,5%, что является достоверным различием.

С целью изучения прогностической значимости были изучены отдаленные результаты лечения 27 больных  РМП, чью судьбу удалось проследить на протяжении 5 лет. У всех пациентов при иммуногистохимическом исследовании ткани опухоли  Ki 67 дал положительную экспрессию.

Из 27 больных РМП 11 пациентам выполнено органосохраняющее, комплексное лечение, включающее в себя трансуретральную электрорезекцию стенки мочевого пузыря вместе с опухолью и системную полихимиотерапию по схеме M-VAC (метотрексат, винбластин, доксорубицин, цисплатин). У 13 больных произведена цистэктомия, а 6 пациентов признаны иноперабельными; им осуществляли только симтоматическую терапию.

Из таблицы 4 видно, что из 27 больных РМП – 16(59,2%) умерло. Из них  10 (62,5%) – в первый год. Из 10 умерших в первый год 9 (90%) пациентов имели экспрессию Ki 67 ≥ 30%. У всех 9 больных  стадия заболевания была Тзb-T4N0-1M0-1.

В то же время из 11 больных РМП, которые прожили более 5 лет, в 70% экспрессия  Ki 67 составила < 30%. Стадия заболевания у выживших больных, была Т1N0M0- 4; Т2N0M0- 6; Т3N0M0-1.

Таким образом, независимо от способа лечения с достоверностью в 81,2% Ki67 может предсказать неблагоприятный исход заболевания в течение 24 месяцев.

При мышечноинвазивном РМП Т2N0M0-Т3-4N0-1M0-1 (22 больных)  в первые 24 месяца умерли 14(62%).   Экспрессия  Ki 67у этих больных колебалась от 30 до 80%.

 При органосохраняющем лечении больных в стадии Т1-Т2 (11 пациентов)  в первые два года умерло 5(45,4%) больных, у которых  экспрессия Ki 67 составляла ≥30%.После  цистэктомии (n=13) умерли 8(61,5%), у 7(87,5%) из них Kj 67 был >30%. Из 11, проживших  5лет  и более лет только в двух  случаях Kj 67 было >30% (34 и 44), у остальных – 9 (82%)  Ki67  был менее 30%.

Заключение. Проведенная сравнительная оценка эффективности различных иммуногистохимических маркеров в стадировании и прогнозе мышечно-инвазивного РМП показала, что наиболее эффективным маркером  является  маркер  пролиферативной   активности  – Ki 67. Установлено,  что  при  экспрессии

Ki 67 >30%,   независимо  от  способа  лечения, с достоверностью в 81, 2%  возможны рецидив заболевания и летальный исход  в течение 24 месяцев. В то же время при значениях Ki67 < 30% пятилетняя выживаемость составляет 70%.

Таким образом, маркер пролиферативной активности – Ki 67 может быть вспомогательным прогностическим фактором при выборе объема оперативного лечения (органосохраняющая операция или цистэктомия).